유전자 편집 기술 Cre-loxP ststem 개념과 작동원리

Cre-loxP system은 유전자를 특정 시점과 원하는 위치(뇌, 간 등) 에서 knock-out 시키는 유전자 편집 기술이다. 요즘 읽는 논문에서 자주 등장하는 실험스킬이라 refernece 를 찾아서 정리해보았다. 마침 이 실험기법에대한 review article을 찾알 수 있었다. 논문 제목은 Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes 이다.

 

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30671100/

 

 

 

구성 요소

구성 요소에는 크게 Cre recombinase 와 loxP 서열이 있다. figure 1. A에서 확인할 수 있다. loxP 유전자는 34bp 로 앞 뒤 쪽으로 똑같은 반복서열(연한 노란색)이 있고 가운데 코어서열(하늘색) Cre recombinase 효소는 loxP 서열의 반복서열을 익식해서 가운데 코어서열을 잘라내는 역할을 한다.

 

작동 원리

figure  A의 첫번째 그림을 보면 초록색 삼각형을 보면 방향성을 갖고 있다. 반복 서열을 같은 방향으로 두느냐, 반대방향으로 두느냐에 따라서 삭제, 반전, 혹은 다른 염색체로 전좌 시킬 수 도 있다.

 

 

 

이 시스템을 구현하기 위해서 특별한 마우스 breeding 을 이용한다. P1,P2 (부모, parents 라 하자) 를 각각 유전자편집기술을 이용해서 P1에는 Cre 효소를 프로모터 앞에 붙여놓는다. 이때 어떤 프로모터를 이용할지가 시간/공간적 조절의 핵심이 된다. (어느 시점에 유전자를 K/O 시킬것인가, 어디에서 K/O 시킬것인가) P2에는 K/O 시키고 싶은 유전자 앞뒤로 loxP를 삽입한다. P1,P2 를 교배 시켜 태어난 쥐에는 cre와 loxP를 모두 가지고 있다.

 

 

태어난 쥐는 바로 target gene 이 KO 되지 않는다. Cre 효소는 ER에 붙어서 대기하고 있다. 즉, loxP 서열을 만나지 못하고 있는 것이다. 마치 달리기 경주를 하는 육상선수들이 레인에 손을 짚고 스프린트를 준비하고 있는 모습을 떠울리면 된다. 실험자가 Tamoxifen을 주입하면 ER에서 Cre가 떨어져 나온다. 위의 그림에서 확인할 수 있다. 심판을 방아쇠를 당긴 것이다. Cre는 핵속으로 들어가 loxP를 만나고 target gene을 제거한다.

target organ 별로 어떤 프로모터를 쓰면 좋은지 정리가 잘 되어있다. 논문의 일부만 발췌했다.

 

위에서 프로모터가 굉장히 중요하다고 했는데 유전자는 제 각각 발현위치/시간이 다르다. 원하는 위치의 유전자를 먼저 확인하고 프로모터 앞에 Cre를 끼워넣는다. 공간적제어의 핵심이 되는 부분이다.  프로모터는 온라인 데이터베이스에 잘 정리되어 있고 실험자가 필요로하는 유전자를 확인하면 된다.