세포배양시에는 항상 오염을 주의하자. 지금 키우는 세포는 Imortalized human drieved brain endothelial cell 세포가 바닥에 붙어서 자라기 때문에 trypsin으로 떼어준다. (5분간 배양기에 넣어두기) 이후 trypsin 과 동일 양의 배지 buffer를 넣어서 trypsin 활성 중지 시킨다. 이 후 centrifuge 2500 rpm, 10분간 돌려주어 cell을 모아서 새배지에 골고루 잘 퍼지도록 해준다. 이 때, 얼마의 배지에 cell을 풀어줄지는 계대배양을 몇 개의 플레이트에 할 것인지와 실험용으로 빠질 양도 생각하여 배지에 풀어 준다.
예를 들어, 저번주 금요일에 5개 플레이트에 키운 세포를 30ml tube에 풀어줬고, 6 well plate 에 2ml씩 64well plate 에 300ul 씩 36well 풀어줬으니 6 x 2= 12 ml 과 300ul x 36 =10.8 ml 대충 23ml, 그리고 700ul씩 8개 plate 에 계대배양 ( 5.6ml) 하여 28~29ml을 알뜰하게 사용하였다. plate에 풀어준 키우놓은 세포는 박사님이 다음주 월요일에 실험에 사용할 예정이고 박사님은 경력이 오래되어 몇번 키워본 세포는 어느정도용량에 몇일 키우면 플레이트에 꽉 차는지 감각적으로 알고 계셨다.
*trypsin
세포를 배양 플라스크나 페펫 등에서 분리할 때 사용된다. Trypsin은 단백질을 분해하는 효소로, 세포를 부착한 표면에서 분리 시켜준다. 세포를 쉽게 채취하고 다른 배지느 용매로 이동할 수 있도록 한다.
우리 실험실에서 사용하는 트립신으로 추정. 설명을 읽어보자.
*Phenol Red
색깔 변화를 통해 pH를 간단하게 확인할 수 있다.
*Osolality
세포배양 환경에서의 일반적인 삼투압은 270~320 mOsm/kg. 1mOsm/kg는 용액 내의 1kg의 물에 대해 1몰의 입자가 존재함을 의미한다.
*cell passaging
세포배양 후 시간이 지나면 세포가 분열하게 되는데 세포가 과밀화되면 적절한 환경에서 자랄 수 없기 때문에 새로운 배지에 이식함으로써 세포의 밀도를 조절하고 성장을 지속시킬 수 있도록 한다.
*EDTA
trysin-EDTA 라 하면 trypsin 과 EDTA가 결합된 형태를 말한다. EDTA는 금속 이온 키렐레이터로 작용하며 칼슘 및 마그네슘 이오을 포함한 금속 이온을 제거하는데 사용한다. EDTA를 같이 사용하는 이유는 세포 표면의 칼슘 이온을 제거하여 세포와 표면 간의 결합을 약화시킨다. trypsin이 효과적으로 작용하는데 도움을 준다.
질문 - trypsin 의 농도는 안 적혀있는지? 세포에 typsin 처리용량은 어디서 확인하는지?
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