세포동결보존 (+DMSO)

im HBMEC 1일차

im HBMEC 2일차

2일차에서 trypsin 처리후 5분 후 모습

 

기억나는대로 적어보자면

1. 세포가 계대배양 할만큼 충분히 자랐는지 확인하기

2. 배양액을 버리고 DPBS로 한번 헹궈주기

3. trypsin 3ml 넣고 배양기에 5분 배양

4. 사용하는 media로 typsin 중성화 시키기

5. 세포와 배양액 2개 tube에 나눠담아 centrifuge 2500 rpm, 5분 돌리기

6. 상층액은 버리고 동결보존용 배지 (DMSO와 FBS 혼합)에 cell 풀어주기

7. 10cm plate 1개당 2개 vial 로 계산하여 6개(1개 vial 당 배지 0.5ml) vial 준비하고 이름,날짜,세대 주기하기

8.  vial을 freezing container에 넣고 deep frezzer 1일 보관 후 액체 질소탱크에 동결보존

 

세포동결보존에 쓰는 배지에는 DMSO가 포함된다.

*DMSO(Dimethyl sulfoxide)는 세포의 내부와 외부 사이를 통과하여 세포 안의 물을 대체하고, 세포의 동결에 따른 세포내의 얼어 있는 물의 결정화를 방지한다. 세포를 얼릴때는 천천히 얼리고 녹일때는 빨리 녹이는게 포인트

 

DMSO (출처: wikipidia)

polar aprotic solvent로 극성,무극성 물질의 용매로 쓰인다.( It is an important polar aprotic solvent that dissolves both polar and nonpolar compounds and is miscible in a wide range of organic solvents as well as water., wikipidia) 만능 용매인가 보다. 논문 읽다보면 자주 보이는데 쥐에게 물질을 경구투여 시킬때도 녹여서 자주 사용된다.

(DMSO is a non-toxic solvent with a median lethal dose higher than ethanol, wikipdia) 에탄올 보다 독성이 적고 non-toxic하다.

 

*frezzing media 는 기존에 쓰던 media , FBS, DMSO를 적절하게 비율구성하여 쓴다. 경험과 랩의 노하우를 참고하면 된다. 보통 DMSO 는 10%로 맞추고 FBS와 media는 세포와 media의 구성, 경험치, reference 참고하기. 얼리고 풀때는 100%다 회복되지 않기 때문에 조금 고농축해서 얼려도된다. (ref. 홍박사님)

 

*frezzing container는 세포를 급격히 얼게하지 않기 위해 천천히 온도를 낮추기 위해 설계됨. freezing container는 ispropanol 로 채워져있음.

 

 

 

[생명과학자 기초체력 다지기] #5_세포 배양

https://www.ibric.org/bric/trend/bio-series.do?mode=series_view&beforeMode=latest_list&newsArticleNo=8859733&articleNo=8882788&title=%5B%EC%83%9D%EB%AA%85%EA%B3%BC%ED%95%99%EC%9E%90+%EA%B8%B0%EC%B4%88%EC%B2%B4%EB%A0%A5+%EB%8B%A4%EC%A7%80%EA%B8%B0%5D+%235_%EC%84%B8%ED%8F%AC+%EB%B0%B0%EC%96%91#!/list