[NGS]Fastq 전처리 방법과 소프트웨어

 

FastQC

https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/index.html

Babraham Bioinformatics

Fastq파일의 read들의 염기와 퀄리티점수를 시각화 해준다.

 

 

ngs ShoRT

https://research.bioinformatics.udel.edu/genomics/ngsShoRT/documentation.html

A Next Generation Sequencing Short Read Trimmer - Documentation

FastQC로 read를 trimming 등의 전처리 작업을 하는 리눅스 패키지

 

가장 일반적으로 쓰이는 trimming method는 lqr_5adpt_tera 이고 위 홈페이지의 document 에 자세한 설명 확인할 수 있다.

일반적인 일루미나의 어댑터는 forward, reverse read 를 구분할 수 없다. paired-end sequence에서 한 가닥만 통과된 경우, surviving_SE_mates.fastq 에 저장되고 저장된 가닥은 forward 인지 reverse 인지 알 수 없다. ngs ShoRT는 한 가닥만 통과되면 pair 되는 가닥도 같이 제거해준다. 5adpt는 사용자가 지정하지 않으면 일루미나 표준 adaptor 을 이용한다.

 

 

 

K-12 표준 대장균 균주에서 유전자 조작을 가한 MT203 균주가 있다. MT203의 read를 K-12 reference에 align 시키면 위 그림과 같이 나타낼 수 있다. 보존되어 있는 파란색 부분과 결실(흰색)됐거나, 획득한 서열(노랑)이 있다. 여러세대 배양을 거치면 자연적인 돌연변이가 생길 수 있다. ex) 위 그림 A → G

 

염기서열을 표준게놈(reference) 와 비교하는데는 주로 BLAST를 이용하지만 BLAST는 자연적인 돌연변이와 같은 작은 변화도 포착하도록 설계되어 있기때문에 시퀀싱 에러, 개체간 차이를 고려할 수 있는 BWA(Burrows-Wheeler Alignment) 를 이용한다.

 

BWA(Burrows-Wheeler Alignment)

https://bio-bwa.sourceforge.net/

Burrows-Wheeler Aligner

bwa 최신판을 설치하면 중간에 에러가 뜨면서 bwa 가 올바르게 설치되지 않는다. 개발자가 2017년을 마지막으로 업데이트를 멈췄다. 너무 오래된 버전이라 현재 C,C++ 버전과 호환성 문제가 생겨서 스크립트 한 줄을 수정해줘야 한다. 아래 링크에서 확인할 수 있다.

 

https://www.biostars.org/p/9521965/

bwa 0.7.18 download to fix compile fail with GCC 10

nano 에디터로 rle.h 에 들어가서 33번 line 의 단어 하나만 수정하고 다시 make 명령어를 입력하면 올바르게 컴파일 된다.

 

NCBI 홈페이지 genome 탭에서 필요한 reference genome 을 다운받는다. 예시로 사용한 Genome assembly ASM584v2 은 e coli의 유전체로 한 가닥의 원형 DNA를 갖는다. fasta 의 확장자는 .fna이다. 컴퓨터가 표준게놈에 접근,검색의 효율을 높이기 위해 인덱싱을 한다. 그 다음, bwa mem 명령어로 mappnig 한다. bwa 결과로 sam 형식의 aglinment 결과파일을 얻는다.