[NGS]SAM/BAM ~ align ~ tablet/VCF format

 

 

 

sam file document 는 구글에 sequence alignment map format specification 검색하면 쉽게 찾을 수 있다.

sam 파일의 각 열에 대한 설명이다. 10,11은 염기와 퀄리티 점수를 갖고 있으므로 반대로 fastq 파일을 만들 수 있다. 

FLAG는 SAM/BAM 파일에서 각 read의 alignment(정렬) 상태를 2진수 비트(bit)로 정의하고 십진수로 변환한다. 여러가지 상태인 경우 모두 합산한 값으로 구한다. 합산값은 고유하다. samtools를 이용하면 FLAG로 리드가 어떤 상태와 특성을 갖는지 확인할 수 있다.

 

Samtools

https://www.htslib.org/

Samtools

 

samtools view : sam을 bam 파일로 변환가능 

bam file은 binary file 이다. bam file을 읽을필요가 있을 때는 sam으로 바꾸거나 view 를 이용해서 볼 수 있다.

samtools sort : bam file을 reference genome 의 위치에 따라서 재정렬 한다. 원래는 read 순서대로 정렬되어있는데 genome 특정 위치에 있는 read를 찾기가 어렵기 때문에 재정렬이 필요하다. sorting 된 file로 samtools index 를 해준다.

 

 

Tablet

https://ics.hutton.ac.uk/tablet/download-tablet/

Download Tablet : Information & Computational Sciences

read alignment 를 시각적으로 확인하는 패키지

GFF 파일(염색체위 유전자가 주석처리 되어있음)도 시각화해서 볼 수 있다.

tablet 예시사진

 

VCF(Variant Calling Format)

read를 참조유전체와 비교하여 다른 부분을 찾아내는 것을 varient calling이라 한다. varient calling 은 haploid, dipoloid 같은 방식을 사용한다. heterozygote 와 homozygote를 확률적으로 계산한다. 어느 한 위치의 염기를 결정하기 위해 read의 그 위치에 퀄리티점수와 각 염기(read)별 개수를 고려한다. 퀄리티가 낮고 read 가 적으면 가능성을 확률은 낮아지는 방식이다.

 

특정 genome 좌표의 유전형을 알기 위해서는, 좌표 위치를 지나는 모든 read의 서열을 모아서 판단을 해야 하므로 genome 전체적으로 실시하여야 한다. 하지만 read 별로 한 행씩 나열되어 있는 SAM/BAM 형식은 전체적인 유전형을 찾는 작업에서는 적합하지 않다. Genome 좌표를 축으로 놓고 해당 좌표에 mapping 되는 read 의 서열을 한 행에 모두 나타내는 형식이 더 적합하다.(VCF format) 이러한 형식으로 변환 시켜주는 프로그램은 bcftools 의 mpileup 이다. mpileup 에 sorted BAM file과 refernece genome 을 input으로 넣는다.

 

https://www.htslib.org/download/

SAMtools/BCFtools/HTSlib - Downloads