[Journal review]Single-Cell Transcriptomics Reveals Zone-Specific Alterations of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Cirrhosis(scRNAseq, confocal image)

매주 저널미팅을 하는데 내 차례는 3주에 한번씩 온다. 매번 읽은 논문을 journal review 카테고리로 만들어 정리하려 한다. 논문의 제목은 Single-Cell Transcriptomics Reveals Zone-Specific Alterations of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Cirrhosis 이고 cmgh 저널(IF=7.1) 에 실린 논문이다, 이 논문을 고른 이유는 내가 하는 연구와 직접적으로 관련이 있고 논문에서 사용하는 연구 방법론 자체가 똑같기 때문에 내가 무엇을 해야하는지, 어떻게 해야하는지 감을 잡을 수 있었다. 특히, scRNAseq 부분에서 새롭게 알게된 부분이 많았기에 다음논문도 scRNAseq technic 위주로 찾아 읽으려 한다.

 

발표를 준비하며 썻던 대본을 GPT로 한번 정리하고 자연스럽게 수정하였다. 이미지들은 ppt의 페이지를 그대로 옮겨왔다. ppt에는 애니메이션이 들어가지만, 글에는 추가할  수 없었다. 논문의 전체흐름에서 중요하지 않은 부분은 제외하였다. 배경이 흰색이라 글과 이미지 프레임의 경계가 보이지 않아 가독성이 떨어져 보여서 배경에 채도를 높여봤다.

 

paper reference

https://www.clinicalkey.com/#!/content/playContent/1-s2.0-S2352345X2030206X?returnurl=https:%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2352345X2030206X%3Fshowall%3Dtrue&referrer=

ClinicalKey

 

 

1. 논문 소개

이 논문은 단일 세포 분석, 간 구역화(liver zonation), 그리고 간경화(cirrhosis)에 관한 연구입니다. 이 연구는 scRNA-seq 데이터 해석 방법과 간 동양혈관내피세포(LSEC)의 이질성(heterogeneity)을 연구하는 방식을 보여줍니다.

 

Background

2. 간의 혈관 구조와 LSEC

• 간 혈관의 구성:
  • 아래에서 올라오는 Portal vein과 위로 빠져나가는 Central vein으로 구성.
  • Portal vein과 Central vein은 일반 **EC (Endothelial Cell)**로 이루어져 있지만, 두 혈관 사이를 연결하는 고유한 혈관은 LSEC으로 구성.
• LSEC의 특징:
  • 위치에 따라 물리적/생리학적 환경이 다름.
  • 논문의 주인공으로 LSEC라는 약칭해서 사용.

간의 혈관을 보자면 아래에서 올라오는 portal vein이 있고 위쪽으로 빠져나가는 central vein이 있다. 여기서 간에 존재하는 혈관세포를 LSEC와 EC를 구별해서 이해해야 한다. portal vein 쪼게서 blood가 빠져나와서 LSEC를 지나 central vein으로 빠져나간다고 생각하면 된다. LSEC(liver sinosodal endothelial cell)은 간 특이적인 기능을 하기위해 독특한 성질을 갖고 있다. 

 

3. Capillarization

• LSEC의 주요 특징:
  • 세포에 구멍이 나 있는 fenestrae 구조로 인해 간의 독특한 기능 수행 가능.
• Capillarization:
  • LSEC가 fenestrae를 잃고 일반 EC처럼 continuous membrane을 갖게 되는 현상.
  • Capillarization이 발생하면 간의 기능 저하를 의미.

LSEC는 간 역할의 핵심 기능을 하기위해 구멍이 송송 뚫려있다. 영어로 'fenestrae' 라 한다. LSEC의 고유한 특징인 'fenestrae'를 잃고 일반 EC처럼 continuous membrane 을 갖게되는 것을 Capillarization 이라한다. (너무 길어지니까 이부분 설명은 생략) 즉, Capillarization 됐다는건 간 기능에 문제가 생겼다고 해석할 수 있다.

 

4. 혈관 조절과 eNOS 역할

• Vascular Tone Regulation:
  • 혈압 조절을 위해 혈관의 수축과 이완이 필요하며 이를 tone이라고 함.
  • 주변의 **SMC (Smooth Muscle Cell)**와 eNOS(Nitric Oxide Synthase)가 주요 역할 수행.
• eNOS 작용 원리:
  • EC에서 생성된 NO가 SMC로 확산 → 혈관 이완 → 혈압 감소.

우리 몸은 항상성 유지를 위해 혈압을 올리고 내리기 위해 혈관의 직경이 조절한다. 이 때 혈관이 이완,수축된 상태를 Vascular tone이라고 한다. 혈관 수축과 이완을 위해서는 주변의 Smooth muscle cell(근육세포)가 이용되는데, 이 때 eNOS가 중요한 역할을 한다. EC에서 만들어진 NO가 SMC로 확산하면 혈관을 이완시켜 혈압을 낮추는 매커니즘이다.

 

5. Graphical Abstract

• 논문은 두 가지 핵심 파트로 구성:
  1. Normal liver에서 LSEC 이질성 규명 및 검증 (scRNA-seq & confocal image 활용).
  2. Cirrhosis 시 LSEC 이질성에 발생하는 변화 분석

6. 실험 설계와 데이터 처리

• Method & Materials:
  • Cre mouse와 tamoxifen을 사용하여 EC에서 GFP 발현 유도.
  • Cirrhosis 모델링 후, GFP+ 세포를 FACS로 분리.
  • SYTOX- 세포만 선택 (죽은 세포 제거).
  • 추출한 세포로 scRNA-seq 수행.

A panel을 보면 modeling scheme을 확인할 수 있다. Cre mouse를 이용해서 sacrifice 전에 tamoxifen 을 먹여서 EC에 GFP를 발현 시켰다. ( 혈관 내피세포에서 GFP channel 형광) 이후 FACS로 GFP+, SYTOX- 로 죽은세포를 제외하는 게이팅을 하고, 10x scRNAseq analysis 하였다.

 

7. 초기 데이터 확인

• Control vs Cirrhosis:
  • 두 조건 모두에서 GFP+ 유전자와 EC marker인 Cdh5가 고르게 발현.
• Doublet 제거:
  • 일부 클러스터에서 EC 외 다른 세포 타입(KC, HSC 등) 유전자 발현 → doublet로 판단하고 제거. (F panel)
• Cluster 6의 독특성:
  • 다른 클러스터와는 완전히 다른 양상 (Vascular vs Lymphatic).

panel E를 보면 GFP+ cell 들이 골고루 발현된거를 봐서 FACS 분류가 잘 됐을거라 판단할 수 있다. 왼쪽 그림을 보자. 현재 cdh5 promotor에 Cre유전자가 삽입되어 있다. ( cdh5-cre mouse)  즉, cdh5가 발현됐다는 의미는 Cre 유전자가 잘 발현되어 유전자 편집이 되어 GFP+가 발현됐다고 볼 수 있다.

 

panel G를보면 cluster 1~5는 어느정도 gradation 을 보이는데 비해 cluster 6는 독립적으로 구분됨을 확인할 수 있다. 왜냐하면 cluster 6은 lympatic vessel 로 본질적으로 EC vessel 과 다른 유전자 발현구성을 하기때문에 당연한 결과이다.

 

8. 공간적 정보 기반 EC 구분

• 공간 정보 없이도 유전자 발현 패턴을 통해 EC 클러스터 구분:
  • vWF, Pecam1: Vascular EC marker → portal/central vein에서 고발현.
  • Lyve1 등: LSEC marker → Cluster 2, 3, 4에서 발현 높음.
  • Wnt2: Central vein marker → Cluster 5에서 가장 높음.

9. LSEC의 zonation 확인

• LSEC Zonation:
  • Cluster 1, 2, 3 → Zone 1, Zone 2, Zone 3로 구분.
• GSEA 분석:
  • Zone 1과 Zone 3이 기능적으로 분리된 경로를 보유.

10. Confocal Image로 검증

• scRNA-seq에서 찾아낸 클러스터와 유전자 발현이 실제 간 조직에서 예상된 위치와 일치하는지 Confocal Image로 검증.
• scRNA-seq 분석의 공간적 정확성을 강화.

11. Cirrhosis에서 LSEC 변화

• Cirrhosis 모델에서:
  • Vascular EC 증가.
  • Lymphatic EC 크게 증가.
  • LSEC는 수적으로 유지.

12. Capillarization 확인

• CD31, CD34를 marker로 사용하여 control vs cirrhosis 비교:
  • Cirrhosis에서 CD34 발현량 증가 → LSEC가 fenestrae를 잃고 일반 모세혈관처럼 변형.

13. Endocytosis 감소

• 간의 주요 기능인 **물질 수송 및 해독(endocytosis)**이 Zone 3에서 크게 감소.
• Cirrhosis로 인한 기능 저하 확인.

14. Vascular Tone Regulation 장애

• eNOS 감소:
  • Cirrhosis에서 eNOS 관련 유전자 발현 전반적으로 감소.
• Receptor Overexpression:
  • 혈관 tone 조절에 교란 발생 가능성.

15. 결론

• Normal liver에서 LSEC 이질성을 규명.
• Cirrhosis에서 LSEC의 병리적 변화와 기능 저하 확인.
• Zone 3가 Cirrhosis에 가장 취약하며, 기능 저하가 두드러짐.